Hepatology：中南大学湘雅三医院曹科团队乙酰化修饰组揭示SIRT1调控RNA m6A促进肝细胞癌发生

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肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC) 侵袭转移能力强，手术切除后复发转移率高，预后极其恶劣。然而肝细胞癌形成和发展的具体机制仍不清楚，缺乏有效治疗方法。从分子水平研究肝细胞癌的发生机制，鉴别出新型的药物靶点，有望帮助开发治疗肝细胞癌的新型疗法。

近日，中南大学湘雅三医院曹科研究员团队在国际期刊Hepatology（IF=14.971）上发表题为SIRT1 regulates N6-methyladenosine RNA modification in hepatocarcinogenesis by inducing RANBP2-dependent FTO SUMOylation的论文，研究者发现去乙酰化酶SIRT1可促进肝细胞癌发生和发展，运用蛋白质组学和乙酰化修饰组学等多角度对SIRT1作用机制深入分析，发现SIRT1激活 SUMO-E3连接酶RANBP2，促进m6A去甲基化酶的SUMO化，进而增加抑癌基因GNAO1和其它肝细胞癌相关基因的m6A修饰，导致肝细胞癌的发生发展。该研究为开发SIRT1作为治疗肝细胞癌的新靶点提供重要依据。景杰生物为该研究的蛋白质组学和乙酰化修饰组学提供了检测和分析工作。

研究者首先对已有的三个肝细胞癌数据库中SIRT1表达量进行了分析，发现SIRT1在肝细胞癌中表达量明显上调，并利用实验在肝细胞癌组织进一步确证了该结果（1A-D）。功能实验发现SIRT1的过表达可促进肝细胞癌Hep3B细胞增殖；SIRT1表达量敲低可明显抑制HepG2细胞的增殖（1E）。结果表明去乙酰化酶SIRT1对促进肝细胞癌的发生具有重要作用。

图1 去乙酰化酶SIRT1促进肝癌的发生

为了探索SIRT1过表达促进肝癌细胞Hep3B增殖的发生机制，研究人员运用蛋白质组学和乙酰化修饰组学技术（质谱策略），分别对SIRT1过表达Hep3B细胞和正常Hep3B细胞进行质谱分析（样本策略），鉴定到SIRT1促进肝癌增殖的差异蛋白质，其中上调蛋白202 个，下调蛋白252个。乙酰化修饰组鉴定到上调蛋白157 个，下调蛋白204个（2A）。分别对差异蛋白质进行GO功能富集分析，发现了大量与RNA m6A的相关生物学过程（2B）。结合生信分析的结果，研究者聚焦到m6A去甲基化酶（FTO），发现FTO的下调对SIRT1介导的肝癌发生是必不可少的，而SIRT1却并非是FTO的直接调控者。

图2 SIRT1依赖 FTO促进肝癌的发生

接下来，为了寻找直接调控FTO蛋白的基因，研究者回顾了蛋白质组和和乙酰化修饰组学GO分析，发现了与蛋白降解的类泛素化修饰(SUMOylation)的生物过程（2B）。在SIRT1过表达的肝癌细胞中SUMO-E3连接酶RANBP2明显上调，而且RANBP2乙酰化修饰水平明显降低（3A和3B）。通过Co-IP和共定位分析进一步证明外源性和内源性SIRT1与RANBP2相互作用（3C和3D）。此外，SIRT1受体激动剂SRT2014能增强RANBP2蛋白的表达，而受体拮抗剂selistat则能有效降低RANBP2的表达，表明SIRT1对RANBP2去乙酰化促进了其稳定性，RANBP2可通过FTO类泛素化修饰而导致FTO的降解（3E-G）。

图3 RANBP2 调控FTO类泛素化修饰和稳定性

研究者进一步通过将本研究的数据库与已报道的两个肝癌临床数据集进行分析，寻找FTO调控的下游基因，最终聚焦到包括GNAO1在内的11个基因。在肝细胞癌Hep3B细胞中，过表达SIRT1显著上调GNAO1 mRNA的m6A的水平，进而下调GNAO1的表达；而FTO过表达则能在很大程度上抑制SIRT1的功能。通过对肝细胞癌数据库，发现肝癌患者的GNAO1表达量明显下调，且GNAO1表达量越低患者生存期越短。体外细胞实验，进一步证明GNAO1表达量敲低可增加肝细胞癌细胞的侵袭。以上实验证明SIRT1通过FTO依赖的m6A修饰降低肝细胞癌抑癌基因GNAO1的表达。

图4 SIRT1通过FTO依赖的m6A修饰降低抑癌基因GNAO1的表达

最后，研究人员通过体内移植瘤小鼠模型实验，证实SIRT1过表达可促进体内肝癌发生，而FTO过表达对SIRT1介导的体内肝细胞癌发生有抑制作用。免疫组织化学实验分析，发现SIRT1过表达可促进肝细胞癌细胞的增殖而减少肝细胞癌细胞的凋亡；而FTO过表达则可对SIRT1介导的促进癌症发生具有有明显的抑制作用。证实了SIRT1可通过下调FTO参与m6A RNA的修饰。

综上所述，本研究综合利用蛋白质组学和乙酰化修饰组学，分别对SIRT1过表达的肝细胞癌细胞样本和肝癌细胞样本进行了分析。研究揭示了SIRT1通过激活 SUMO-E3连接酶RANBP2，活化的RANBP2促进FTO-sumoylization而降解，进而升高了抑癌基因GNAO1和其它肝细胞癌相关基因的m6A修饰水平,导致肝细胞癌的发生发展。

参考文献

1. Xiaoming Liu, et al., 2020, SIRT1 regulates N6-methyladenosine RNA modification in hepatocarcinogenesis by inducing RANBP2-dependent FTO SUMOylation. Hepatology.

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